三维细胞培养的前沿科学问题 ─香山科学会议第514次学术讨论会综述
细胞是生物形态结构和生命活动的基本单位。细胞培养是细胞生物学、组织工程、生物医学工程和药物开发中的关键步骤。研究三维细胞培养的前沿科学问题，将此技术用于开发基于病人自身基因和细胞信息的治疗方案，可以为实现个性化医疗提供强有力的理论指导和技术支撑，从而提升生命科学研究及国民健康水平，并为引领国家相关产业战略性升级提供了重要的机遇。目前人们对细胞结构的认识从细胞整体、细胞内亚结构，到分子结构，而且对细胞内分子、结构之间的相互作用，细胞的物质输运、新陈代谢、信号传递等现象和机制的探索逐渐深入。国内外在空间微重力环境下的三维细胞培养方面已经进行了卓有成效的研究工作。
自上个世纪九十年代微型全分析系统的概念提出以来，微流控芯片得到了迅猛的发展，已经为细胞/组织培养的生物物理研究提供了极其重要的新一代科学技术平台。目前在微芯片上实现细胞的悬浮培养的可能性、微环境对细胞培养的影响、三维细胞培养环境的动态测量等许多学术问题正处于深入研究中。实现精确可控、标准化的细胞/组织培养是该项前沿技术服务于国民经济、实现大规模产业化的前提，这就要求人们对其中复杂的生物、化学、物理等过程由以实验观测为主的描述型研究转型为模型化的定量研究。着眼于空间生物技术在细胞/组织培养方面的成果，利用微流控芯片优异的可操控性，对细胞/组织的三维功能化构建过程进行模型化研究，是极具应用前景的交叉研究方向。
为利用空间技术和微芯片技术进行三维细胞培养的专家学者提供跨学科学术交流平台，对国内外三维细胞培养的发展现状、相关科学问题以及关键的实验技术和理论方法进行深入的交流和探讨，探索我国三维细胞培养的研究目标、途径及方法，以及各项关键技术可能的解决方案及策略。香山科学会议于2014年12月2日~4日在北京香山饭店召开了以“三维细胞培养的前沿科学问题”为主题的第514次学术讨论会，会议由胡文瑞研究员、林炳承研究员、周哲玮教授、段恩奎研究员担任执行主席，来自高等院校、科研院所和管理部门的国内外40多位专家学者应邀参加了讨论会。与会专家围绕（1）微流控芯片中的三维细胞培养；（2）空间生物技术中的三维细胞/组织培养；（3）微环境对细胞生长和运动影响的机理研究等中心议题进行深入讨论，并提出了建议。
一、主题评述报告
龙勉研究员作了题为“细胞三维生长的力学－生物学耦合”的主题评述报告，他指出细胞三维生长具有重要的生物医学意义。从基础层面，认识细胞三维生长基本规律是定量认识生命活动和生物学过程的重要基础。无论生物体内生理环境的复杂性和不可观测性，还是体外细胞二维生长模型的生物学局限，均促使从三维视角认识细胞生长的规律。从应用层面，细胞三维生长不仅是再生医学、组织/器官构建的基础，还针对性地应用于创伤修复、康复工程等方面，而且也为研究提供了微尺度流动下具有生命活动的流动规律提供了新的模型。他认为目前三维细胞培养主要包括以下六个问题：1）细胞在材料表面的附着；2）细胞在三维表面的生长；3）细胞三维生长的物质输运；4）细胞三维生长的动力学；5）细胞三维生长的生理微环境再现；6）跨尺度三维细胞培养体系/系统的动态构建。国际空间生命科学在三维细胞培养方面值得关注的动态，包括：1）3D支架选择；2）多种细胞的共培养；3）接触控制；4）基于微球或微液滴的培养；5）基于微流控芯片的三维细胞培养；6）灌流培养；7）3D生物打印，由形似做到神似；8)基于微流控芯片的微器官，可用于药物筛选评价。
讨论中，与会专家认为，空间三维细胞培养与地面三维细胞培养的关注点有所不同，两者都是为了提供新一代的个体治疗技术。在微尺度下可忽略重力效应，地面上实现细胞三维培养最有前景的技术是利用微流动芯片。细胞的培养关键是需要培养过程提供真实的生物微环境，体外培养作为体内治疗的工具，必须保证体外尽量再现体内真实环境。对于细胞的认识尚有不足，需要加强力学、物理、化学交叉研究。可以通过“力学驯化”等手段对培养的细胞功能进行调制。与会专家普遍认为，三维细胞培养是关乎人类健康、太空探索的重要问题，必须大力推进，凝练出重要科学问题，找到主要的发展方向。
二、微流控芯片中的三维细胞培养
与会专家在报告中，介绍了细胞及其微环境的三维培养和相应的细胞/器官芯片，以及这类芯片在药物研究和开发中的突破性应用, 强调三维培养比二维更接近真实生命体，能更好地再现细胞生长的微环境。认为微流控芯片是一种极为重要的哺乳动物细胞及其微环境的三维培养平台技术, 在现阶段具有一定的不可取代性。通过多器官、多体液组合规模集成的新型三维器官芯片已被用于肝、肠、肾等药物代谢、药理毒性/活性评价。细胞微流控芯片已成为当今体外细胞培养和研究的强有力工具。自行开发研制的微流控系统应用通过微型化、集成化、自动化、精细化的微流控芯片实现了可控微环境、多参数组合、高通量高灵敏度的分选和检测。通过我国科学家与美国哈佛大学国际顶尖课题组合作，设计并开发了多款可重封灌注式生物反应器，对多种器官进行了灌注培养，模块化设计器官芯片，并以表皮再生与肝脏芯片为例，介绍相关关键技术以及10万/秒量级快速循环肿瘤细胞检测芯片方面的工作，认为微流控芯片是发展生物医学研究的重要工具。细胞在生长过程中对环境的温度、营养液浓度、流场速度和剪切力等参数的影响非常敏感，为了真实再现细胞生长过程，要对其培养环境进行定量、实时观测。
三、空间生物技术中的三维细胞/组织培养
与会专家在报告中，结合早期胚胎发育的关键条件，指出干细胞的三维培养微环境涉及到生物化学环境和物理环境。研究表明二维平面培养与细胞在机体内所处的真实微环境存在很大的不同，三维培养体系在研究（干）细胞生长、分化和组织形成的机制和生物学规律上具有明显优势。当前地面模拟微重力研究和空间飞行实验都表明微重力环境对细胞的形态、细胞的增殖、定向诱导分化以及基因表达具有一定的影响。地面模拟微重力生物反应器产生的并非完全意义上的微重力环境。研制的反应器采用功能模块化、模块标准化、系统集成化设计，具有贴壁细胞培养、干细胞、细胞和组织等生物样品动态悬浮培养、实时（荧光）显微观察和在线调控等功能，解决了贴壁细胞、干细胞与组织的空间三维培养等研究中所必需的空间实验硬件和相关关键技术。利用灌流培养体系产生不同的流体剪切力，间歇性流体剪切力较持续性流体剪切力能有效地促进hMSCs（人骨髓间充质干细胞）向成骨细胞分化，证明了在成骨分化的信号转导机制中，细胞中的整合素能够感受剪切力的刺激进而引起一系列的活化响应，该结果对研究力的作用在细胞生长中的作用具有重要的指导意义。空间环境对干细胞增殖、分化及三维工程化组织体外再造方面表现出明显优势，尤其是在微重力组织工程化软骨、心肌、胰岛以及肝脏等方面取得了一系列成果。微流控组织/器官芯片是细胞三维培养的焦点，在芯片上模拟人体环境进行多种细胞、组织和器官的联合培养和组织功能的再现将成为热点。
四、微环境对细胞生长和运动影响的机理研究
与会专家在报告中，指出理解细胞器和各种蛋白在细胞质中的复杂运动对细胞培养技术的发展起到关键作用。以线虫卵细胞内相变机制和果蝇胚胎细胞中成形素浓度梯度的形成，阐述了流体输运对细胞生长的影响。线虫卵细胞内遗传物质P颗粒在前部和后部具有浓度差，类似“相变”机制。果蝇胚胎中的Bicoid蛋白可以在胚胎细胞中形成一定的浓度梯度，从而决定细胞的位置信息，最终发育分化成特定的、不同形态的组织。通过模拟对流扩散模型，研究了上述浓度梯度的形成过程，得到了与实验相符合的结果。细胞的精确操控在生物学研究中有着极为重要的意义。惯性微流控是基于流体惯性效应在微纳尺度上操控颗粒的一种新技术。通过直接数值模拟和实验方法，设计了具有不同通道构型的微流控器件，结合不同的流动条件和流体特性，有效实现了微纳米颗粒、循环肿瘤细胞、大肠杆菌的汇聚、分离和富集。细胞在毛细血管中的变形与迁移以及细胞与基质间发生粘附的研究有助于了解细胞响应外力作用以及细胞间力学信息交流。疏水的体外颗粒进入生物体内时，会把生物细胞内外正常的疏水相互作用秩序打乱。在分子水平上利用不同形态的纳米结构对细胞的功能进行调控，为细胞培养提供可靠的物理现象和机制。营养液的输运问题是细胞培养中的关键问题之一，由温度分布不均匀引起的热毛细迁移技术是诱导液滴迁移的重要手段，受到国内外微重力科学界的广泛重视。
会议总结与专家建议
在经过广泛交流和深入讨论后，与会专家取得了以下共识：
一、大家一致认为：
1、三维细胞/组织培养是实现个性化医疗的重要过程和保障，是引领新兴产业具有发展前景的重大科学研究方向。目前空间和地面三维细胞培养已有各自的特点与优势。凝练包括空间科学、数理科学、微流控芯片、生物医学在内的跨学科研究团队，有望在科学研究与实现产业化两方面形成突破。
2、空间生物技术取得了长足的发展。空间细胞培养的优势是，利用微重力环境，三维悬浮培养技术为细胞之间提供了生物亲和性良好的相互接触，有助于改善培养质量和效率。但成本高昂、不易进行直接实验观测等特点给其发展带来了一定的局限性。
3、微流控芯片因其良好的可操控性，成为新一代细胞/组织研究的平台。目前微流控芯片中的三维细胞培养主要以水凝胶为培养骨架。如能利用微流控芯片的尺度效应，实现细胞的三维悬浮培养，结合空间培养技术的优势，不仅将极大地降低空间实验所需的成本，也有助于提高该项技术的可操控性。
4、实现精确可控、标准化的三维细胞培养是该技术工程化、大规模产业化的前提。目前该领域的研究正在由经验性研究向模型化研究过渡，亟需有数理科学基础专家的参与、合作，组建跨学科研究团队，促使从基本科学问题到产业需求的全链条科研队伍的形成。
二、与会专家认为关键的科学问题有：
1、三维细胞/组织培养过程中细胞与微环境之间作用关系的研究
主要包括：三维细胞/组织微环境中的力场，如重力场、流体剪应力场等，对细胞的生长和发育的作用；力的信号如何转化为生物化学信号，如何影响物质的输运过程，如扩散、渗透和主动运输等；细胞在材料上的粘附力及其影响因素的作用机制等。
2、三维细胞/组织培养过程中多细胞协同生长规律的研究
主要包括：在不同应力场环境和培养液时，研究多种细胞生长过程中性质、形态和功能的改变；研究三维多尺度结构及微纳尺度流动对细胞的协同生长促进规律；研究三维细胞培养中养分输运和新陈代谢的机制；细胞和细胞之间的相互作用，以及细胞团聚的规律等。
3、微流控芯片系统的设计与优化
主要包括：探索微流控芯片中实现细胞悬浮培养的新途径；对微流控芯片中涉及的微纳尺度流动机理的研究；对微流控芯片内部各功能单元，如反应单元，预混单元等，以及通道的结构设计优化；对微流控芯片实现快速检测功能的控制系统的优化。
4、细胞/组织培养的标准化研究
主要包括：利用微流控芯片提高三维细胞培养的可控性；促进地面和空间培养中检测的标准化进程；利用模型化研究细胞生长过程中的现象和规律，为工程应用乃至产业化打下基础。
三、与会专家就如何推动我国细胞三维培养领域的研究，提出了以下建议：
1、三维细胞培养中不仅蕴含了诸多挑战性的科学问题，涉及诸多学科的交叉和融合，而且是实现个性化医疗技术的重要一环，兼具巨大的基础科学和工程应用价值。政府部门应密切关注该领域的动态和发展，为该领域的科研成果转化及产业化创造条件，积极扶持，提供必要的协调和帮助，为该前沿技术引领产业升级提供契机。
2、由于该领域的学科交叉性，兼之我国的科研机构学科划分较细，科技管理部门应积极创造各种跨学科研究和交流平台，便于科学家之间的有效交流和互动。并全力组织跨领域、跨学科的学术力量，就三维细胞/组织培养中的关键科学和技术问题联合攻关。
3、学术界应积极破除学科之间的界限，加强跨学科的交流与合作，积极关注三维细胞/组织培养技术的规范化和标准化，为其大规模生产提供有力的理论指导。该领域正在经历由实验观测和描述为主的研究，向基于基本科学原理的模型化研究过渡阶段，生物科学学术界应特别注意发挥数理、力学等学科专家的作用。
4、运用数理科学知识解决生命科学和技术中的问题是学术界面临的长期问题。这要求研究人员既有丰富的生物学知识，也要求其具有扎实广博的数理科学基础。教育部门应积极响应这一潮流，加强生物科学相关专业本科生、研究生的数理基础课程的学习，或采取增开交叉学科学位点等措施。
